人工染色体ベクター

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人工染色体ベクター

  鳥取大学医学系押村光雄教授らのグループにより開発された人工染色体ベクターは、ヒトあるいはマウス染色体から細胞内での染色体の維持や分裂に不要な遺伝子領域を削除することにより開発され、それぞれHAC(ヒト染色体由来の人工染色体:human artificial chromosome)ベクターまたはMAC(マウス染色体由来の人工染色体:mouse artificial chromosome)と称しています。

  これらの人工染色体ベクターは染色体としての性質を引き継いでいるため、これまでのプラスミド/ウイルスベクターとは大きく異なる性質を有しています。

 プラスミド/ウイルスベクター等による安定的な遺伝子発現細胞株の構築方法では、目的の外来遺伝子が組込まれたベクターが維持されるには宿主染色体上に挿入されなければならず、その際にベクターはランダムに宿主染色体上に挿入され、かつコピー数も様々であるため、コントロールが困難でした。

<従来法(プラスミド/ウイルスベクター)の問題点>

  1. 導入されるDNAサイズの制限
  2. 外来遺伝子の挿入による宿主遺伝子の破壊
  3. 外来遺伝子の挿入によるがん化等の細胞の性質変化
  4. 挿入部位やコピー数の違いによるクローン間での発現量の差異
  5. 継代培養によるジーンサイレンシング

  人工染色体ベクターは、宿主細胞株内で宿主染色体とは独立して保持されることから、上記の問題を解決することができます。

ヒト人工染色体 HAC ベクター構築方法

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参考文献:Y. Kazuki et al., Gene Therapy (2011) 18 384-393

人工染色体ベクターの特徴

  人工染色体ベクターは、従来のベクターと比較して以下に示すような利点が存在し、安定遺伝子発現細胞株の構築、遺伝子組換え動物の作製やタンパク質高生産細胞の構築など、様々な用途での利用が期待されます。
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高度な実験動物作製

弊社では、これまで培ってきた染色体工学技術を利用して染色体移入マウスの作製を行っておりました。
その他には、マウスES細胞を用いた遺伝子改変およびキメラマウス作製等がございます。

染色体移入マウス

弊社で開発された人工染色体ベクターを用いて、外来遺伝子を導入した遺伝子組換えマウス(染色体移入マウス)の作製を行っています。
人工染色体ベクターは、生殖細胞系を通じて子孫伝達させることが可能であることや、搭載できる遺伝子サイズに制限がないなどの特徴を有しています。

このような人工染色体ベクターを利用し染色体移入マウスを構築することにより、これまでのノックイン法などでは構築が不可能だった巨大な外来遺伝子を含む遺伝子組換えマウスや、特定の制御領域を搭載することにより組織特異的・時期特異的に遺伝子を発現させることが出来ますし、コピー数によって発現量をコントロールすることも可能になります。

弊社は染色体移入マウスの実施例として、薬物代謝に関与することが知られているヒトCYP3A遺伝子群を導入したマウスの開発に成功しています。

染色体移入マウスの作製方法


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in vitroとin vivoの比較

人工染色体ベクターは微小核細胞融合法により様々な細胞に移入することが可能であるだけでなく、安定に維持させることが可能です。
人工染色体ベクターを用いてin vitro評価用細胞とin vivo評価用マウス個体を作製し両者での比較をすることが出来ますし、疾患モデル細胞を免疫不全マウスに移植することによって、in vitroとin vivo での比較をすることなども可能になります。

人工染色体ベクターを用いた in vitro と in vivo 評価系の比較

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トランスジェニックマウス/ノックインマウス

通常のトランスジェニックマウス/ノックインマウスの開発サービスを行っておりました。
弊社の得意とする染色体解析によりES細胞の核型解析、外来遺伝子の挿入部位の特定やコピー数の確認を行うことにより高品位な遺伝子組換えマウスを作製することが可能です。

ヒト型薬物代謝モデル動物


 医薬品開発プロセスにおいて、早期の段階で薬物動態・安全性を試験することは開発効率を上げるために有意であると考えられます。しかしながら、マウス、ラットなどの実験動物とヒトにおける薬物代謝関連酵素の種差が存在するため、臨床試験での段階でドロップアウトしてしまうことが多々あります。

 薬物代謝関連酵素のうち、CYP3Aは上市されている医薬品の約40%の代謝に関連することが知られており、ヒト型化が望まれていました。
しかし、ヒトのCYP3A遺伝子群 (CYP3A5, CYP3A7, CYP3A4, CYP3A43) は 7番染色体上に約700 kb のクラスターとして存在しており、既存の技術でクラスター全てを同時にヒト型化することは困難でした。
また、遺伝子導入を行う際に外来プロモーターによる強制発現系が一般的ですが、組織特異的または時期特異的な発現をヒトに近づけることが難しいという問題もありました。

弊社では、基盤技術である人工染色体ベクター技術を応用することにより、4種類のCYP3A遺伝子の搭載のみならず、内在性のCYP3Aプロモーター領域も搭載することに成功しました。

 これにより、組織特異的または時期特異的な遺伝子発現が可能となり、他の薬物代謝モデルマウスに無い様々な性質を獲得することに成功しました。

ヒト型CYP3Aマウスの構築


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 loxP配列を挿入したヒト7番染色体由来断片とHACベクターを同一細胞で共存させた後、部位特異的組換えによりヒトCYP3A遺伝子群を含む領域をHACベクター上に転座クローニングいたしました。FISH解析により、人工染色体ベクター (赤色) 上にヒトCYP3A遺伝子群 (緑色) が転座されていることが解ります。
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 構築したCYP3A-HAC ベクターを微小核細胞融合法によりマウスES細胞に移入しました。
得られたマウス組換えES細胞を用いてからキメラマウスを作製し、キメラマウスよりCYP3A-HACベクターを子孫伝達させ、ヒト型SYP3Aマウスを作製しました。これらの人工染色体を保持するマウスは、野生型のマウスよりも染色体数が1本多いですが、正常に発生し子孫にも人工染色体が伝達します。

ヒト型CYP3Aマウスの特徴

 弊社CYP3Aマウスは、ヒトCYP3A遺伝子の上流に存在する制御領域を含んでいるため、CYP3A遺伝子の組織特異的・時期特異的発現並びに発現量がヒトと類似しています。上記のように生理的な環境によって遺伝子発現が制御されることから、動物個体レベルでの薬物動態試験や毒性試験、催奇形性試験等の毒性試験にご利用いただけます。

各組織における遺伝子発現解析

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 ヒト型CYP3Aマウスの各組織より mRNAを調製し、RT-PCR によりCYP3A4、3A5、3A43の発現特異性を調べました。ヒトCYP3Aプロモーターを用いて遺伝子発現を行うことにより、各CYP3A分子種は組織特異的に発現していることが示されました。
down_arrow_mark 以上のことから、医薬品候補化合物の影響を効果的に調べることができると考えられます。

肝臓におけるCYP3Aの時期特異的発現


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 胎仔期から成体期の各時期の肝臓からmRNAを調製し、RT-PCRによってCYP3A4および CYP3A7の発現を調べました。その結果、ヒトの場合と同様にCYP3A7は胎仔期特異的に発現が見られ、出生後はCYP3A4が発現することが明らかとなりました。
down_arrow_mark以上のことからCYP3Aマウスは医薬品候補化合物の催奇形性試験にも利用できると期待されます。

肝臓ミクロソームにおけるCYP3Aの発現量 (ウェスタンブロット解析)

 弊社CYP3Aマウスの肝臓におけるCYP3Aの発現量をウエスタンプロット法により確認したところ、市販のヒト肝ミクロソームにおけるCYP3A発現量の平均程度であることがわかりました。また、CYP3Aの発現は生活環境による影響を大きく受け、個人差が大きいことが知られていますが、弊社CYP3Aマウスにおける肝臓でのCYP3Aの発現は個体差が小さく、創薬プロセスにおける薬物動態試験や安全性試験として有用であると考えられます。

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in vitro小核試験

  in vitro小核試験はAmes 試験で陽性となった変異原性候補化合物について、主に骨髄細胞を利用して染色体異常誘発性頻度を測定する試験法です。ヒト型CYP3Aマウスより調製したS9画分を使用して、Aminoanntracene(2AA)を変異原としたin vitro小核試験を行った結果、CYP3A酵素系がされたことによりマウスあるいはラット由来S9画分を使用した場合と比較して高い小核出現率が見られました。

  以上のように、弊社の基盤技術であるヒト型CYP3Aマウスと染色体解析技術を組み合わせることにより、変異原性試験においてより高精度な解析結果が得られることが期待できます。また、ヒト型CYP3Aマウスより調製した初代培養肝細胞を利用したin vitro小核試験も対応可能ですのでお問い合わせください。
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薬物動態試験


弊社ではヒト型CYP3Aマウスを用いた薬物動態試験受託サービス(非GLP試験)を行っておりました。

筋ジストロフィーモデルマウスの治療

  ヒトジストロフィン遺伝子は全長で2.4Mbあり79のエクソンから成る巨大な遺伝子です。
  鳥取大学医学系研究科の押村教授らのグループでは、ヒトジストロフィン遺伝子を搭載したHACベクターを筋ジストロフィーマウスモデルの細胞に導入し、細胞移植することにより、筋ジストロフィーモデルマウスの症状を軽減させることに成功いたしました 。
【論文(PubID:21849666))】

ヒトジストロフィン遺伝子を含む人工染色体ベクター

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ヒトジストロフィン遺伝子を搭載した人工染色体ベクターを保有する細胞の移植

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  1. 筋ジストロフィーモデルモデルマウス (mdx) より中胚葉系性血管芽細胞 (mdxMABs) を採取
  2. ヒトジストロフィン遺伝子を搭載した人工染色体ベクター (DYS-HAC) を微小核細胞融合 (MMCT) 法により中胚葉性血管芽細胞に導入
  3. DYS-HAC ベクターを含む細胞を選択し、MyoD と nLacZ を発現するレンチウィルスを感染
  4. in vitro での評価 (クローン選択、増殖解析、分化解析)
  5. 4.で選択した中胚葉性血液芽細胞を免疫不全な筋ジストロフィーモデルマウス (SCID/mdx) へ移植
  6. ジストロフィン遺伝子発現、形態解析、機能回復試験の実施

DYS-HACベクターを導入した細胞を移植したマウスにおける発現解析

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  ウェスタンブロット法による前脛骨筋におけるジストロフィンタンパク質 (Dys 427 kDa) の発現確認を行いました。
 正常マウスでは ジストロフィン タンパク質 (Dys) の発現が見られました(右:Untreated SCID)。
 一方、筋ジストロフィ―モデルマウスではDys タンパク質の発現が見られません (中央 Untreated SCID/mdx)。
 Dys-HAC ベクターを導入したマウス (左:Treated SCID/mdx)では導入したヒトジストロフィン遺伝子が発現していることが示されました。

FVIII遺伝子の発現

 FVIIIタンパク質は血液凝固因子の一つであり、この遺伝子の機能不全は血友病Aの原因となることが知られております。鳥取大学押村教授らのグループは、タンデムに連結した16コピーのFVIII遺伝子をHACベクターに搭載したCHO細胞およびヒト間葉系幹細胞へ導入することに成功しました。【論文(PubID:21833006)】
 人工染色体ベクターによる発現は長期間にわたり安定であり、遺伝子治療のほかにタンパク質生産系への利用が期待できます

HACベクターへのFVIII 遺伝子の搭載方法

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  ヒト21番染色体から長腕および短腕を削除したHACベクターに1-16コピーのFVIII遺伝子を搭載しました。

FVIII遺伝子コピー数によるFVIIIタンパク質生産量への影響

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  搭載したFVIII遺伝子のコピー数によるFVIIIタンパク質の生産量の影響を評価しました。搭載するFVIII遺伝子数を増やすにつれてFVIIIタンパク質の生産量は増加し、16コピーの場合には1コピーの場合と比較して約10倍の生産量を示すことが明らかとなりました。

発現の長期安定性

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 ヒト間葉系幹細胞内におけるFVIII遺伝子の発現安定性を評価しました。16コピーのFVIII遺伝子をPACベクターに組み込んで導入した系(◇)では50世代培養後には発現量は10-40%に低下していますが、HACベクター上に16コピーのFVIII遺伝子を搭載した系(□)では50世代後も発現はほとんど変化しないことが示されました。